派森诺客户发表综述，带您畅游果蔬表皮微生物组的奇妙世界！

最近，《Microbial Biotechnology》上发表了一篇综述文章，探讨了高通量测序技术在蔬菜与水果表皮微生物组研究上取得的成果。

众所周知，各种蔬菜水果，尤其是可以带皮吃的，我们在食用之前通常都会洗洗再吃，不然这里面会有很多“脏东西”，吃完容易生病。那这些所谓的“脏东西”究竟是什么呢？泥土、农药、污染物？当然不止，还有数量非常庞大，但我们肉眼却看不见的微生物！就是这些体型极其微小的微生物，却能给我们的生活带来非常大的影响，接下来，小编给大家介绍下，这些存在于蔬菜水果表皮上，能让人或植物生病的微生物。

在此之前，小编必须先给大家介绍这位让我们有机会深入了解微生物群落的大功臣：DNA测序技术！在测序技术出现之前，我们只能基于菌群培养，根据菌群的宏观形态或显微镜下的形态，做一些宏观上的研究。

而随着测序技术的发展，人们得以从核酸水平上研究微生物，获得各种各样的标记基因（遗传标记），根据这些基因信息，便能基于pCR技术（比如传统pCR、qpCR、多重pCR和基因芯片等）对微生物组进行检测，极大的提高了食源性致病菌和植物病原体监测的准确性与便捷性。今天给大家介绍的这篇综述，便详细介绍了测序技术在果蔬表皮微生物组的研究上所取得的最新进展。

研究进展

1. DNA测序技术与果蔬表皮微生物组的遗传标记

1.1 食源性致病细菌

提到肠道疾病，我们首先想到的可能是食物中毒、腹泻、呕吐等常见疾病或症状，而水果蔬菜表皮上携带的致病细菌就会导致这类疾病的产生，比如大肠杆菌（Escherichia）、沙门氏菌（Salmonella）、葡萄球菌（Staphylococcus）、李斯特菌（Listeria）、志贺氏杆菌（Shigella）以及弯曲杆菌（Campylobacter）。

大肠杆菌属主要包括三种病原菌：E. coli、E. albertii和E. fergusonii。其中，有的E. coli便会导致食物中毒，它通常存在于动物肠道中，可通过粪便释放到环境中去，因此，E. coli的数量也可以反映蔬菜水果受粪便污染的程度。针对不同的大肠杆菌，目前我们可以通过16S rRNA基因测序和多重pCR进行鉴定与区分，详见下表：

大肠杆菌

可用于鉴定的遗传标记

E.coli

eae，stx1，stx2；Vt1，Vt2；fliC，uspA，lacZ，rfbE，ipaH，lacY，uidA，phoA，cdtB

E.albertii

16S rRNA基因，细胞膨胀致死毒素基因（cdtB）和半胱氨酸的生物合成基因（EAKF1_ch4033）

E.fergusonii

yliE，EFER_1569和EFER_3126（多重pCR）

沙门氏菌属主要包括的病原菌是肠球菌（S. enterica）和斑梭菌（S. bongori）。肠球菌又可分为6个亚种：enterica（I）、salamae（II）、arizonae（IIIa）、diarizonae（IIIb）、houtenae（IV）和indica（VI）。其中，enterica（I）便是引起食源性腹泻的主要原因。目前主要使用多重pCR进行沙门氏菌的鉴定，详情见下表：

沙门氏菌

可用于鉴定的遗传标记

Salmonella

fljB，gatD，invA，mdcA，stn，STM4057

S. enterica

16SrRNA基因，AceK，fliC，invA，oriC，sdf，sefA，ssaN，STM2745，STM4492

S. bongori

fliC，gnd，mutS

李斯特菌属包含了L. monocytogenes和L. seeligeri这两种致病菌。其中L. monocytogenes（单核细胞增多性李斯特菌）是一种重要的食品源致病菌，能污染各种蔬菜水果，引起人李斯特菌病，目前可根据hly、iap、mpl、prfA、inlA、inlB、actA、plcA和16S RNA基因进行鉴定。

葡萄球菌属主要与皮肤感染和食物中毒有关，比如S. aureus（金黄色葡萄球菌）就是一种与毒素型食物中毒有关的重要病原体。

志贺氏杆菌属则能够污染多种食物，并表现出不同的发病率和流行病学。比如S. dysenteriae（痢疾杆菌）会引起致死性流行病，S. flexneri会引起地方性传染。有意思的是，与S. boydii相关的食源性疾病主要发生在发展中国家，而与S. sonnei相关的食源性疾病主要发生在发达国家。

弯曲杆菌属的C. coli也是一种会表现出独特流行病学特征的病原体。关于葡萄球菌属、志贺氏杆菌属、弯曲杆菌属的鉴定，综述原文中有详细描述，感兴趣的老师可以在原文中查看。

常见食源性致病细菌的基因组特征

1.2 植物病原真菌

民以食为天，蔬菜水果等农产品毫无疑问与人类的生活息息相关，而植物病原真菌却会导致植物病害，严重影响农产品价值。利用DNA测序技术，目前研究发现的植物病原真菌主要有：青霉菌属（penicillium）、链格孢属（Alternaria）、曲霉菌属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）、炭疽菌属（Colletotrichum）、链核盘菌属（Monilinia）、葡萄孢属（Botrytis）。

青霉菌属与蔬菜水果采摘后腐烂有关，病原真菌主要有p. expansum、p. digitatum、p. griseofulvum、p. italicum和p. citrinum。其中，p. digitatum和p. italicum会引起柑桔类水果采后发霉。

不过，即使是病原菌，也有可利用之处。比如，p. chrysogenum可用于制作工业青霉素，p. expansum也被运用到棒曲霉素和橘霉素的生产中。在青霉菌属的鉴定上，目前主要是用RApD、SNp和微卫星分析来鉴定青霉菌属的各种菌。同时，异环氧脱氢酶（IDH）基因可用于区分产青霉素和不产青霉素的青霉菌；patF、ITS 、pepg1等基因可用于p. expansum的鉴定。

炭疽菌属包含的病原菌主要有：C. gloeosporioides、C. acutatum（广泛感染蔬菜水果）、C. coccodes和C. fructicola。其中，C. gloeosporioides会感染很多作物，使其患炭疽病。

在炭疽菌属的检测上，可用的基因有：ITS、β-tubulin、actin、act、ApMat、cal、chs1、gapdh、gs、his3、tub2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和oxidase subunit1。

链格孢属主要包含A. alternata、A. arborescens、A. brassicicola和A. solani这几种病原菌。它们通常会引起植物病害和采后腐烂，有的甚至还能产生宿主特异性毒素（HSTs）。

曲霉菌属包含的真菌种类很多。其中，病原菌有A. flavus、A. parasiticus、A. carbonarius、A. niger、A. tubingensis和A. westerdijkiae，它们会造成农作物腐烂，并产生黄曲霉毒素和赭曲霉毒素。其中，黄曲霉毒素的生物合成和调控基因（aflR、aflS、aflD、aflM、aflp、aflQ、aflO、aflQ）目前被广泛用于产黄曲霉毒素物种的鉴定中。

镰刀菌属包含的致病真菌较多，包括F. oxysporum、F. fujikuroi、F. verticillioides和F. proliferatum，它们会在农作物和蔬菜中引起严重的疾病，并产生单端孢霉烯族真菌毒素。比如F. fujikuroi便能引起水稻恶苗病，并产生赤霉素（GAs）。

另外，链核盘菌属真菌会导致水果和蔬菜表面出现褐斑（褐腐病），葡萄孢属的真菌B. cinerea，则会在水果与蔬菜表面引起严重的灰霉病。原文中有对这些微生物详细的介绍，感兴趣的老师可以去原文中查看哦。

常见植物病原真菌的基因组特征

2. 果蔬表皮微生物群落的影响因素

目前，大量研究利用高通量测序技术，基于16S rRNA基因与ITS的序列特征，对果蔬表皮的细菌与真菌群落进行了研究。在本篇综述中，作者在Science、NCBI、ScienceDirect和CNKI查阅并发现了64篇描述各种果蔬表皮菌群的研究，这些研究大多使用的是Illumina与Roche 454焦磷酸测序技术，主要可分为三类：
①不同植物/基因型之间的微生物群落多样性比较；
②地理/环境因素和耕作方法对微生物群落的影响；
③储存和加工过程中，人工处理和质控过程对微生物群落的影响。

2.1 不同植物/基因型之间的微生物群落

目前已经有文献报道不同水果和蔬菜叶片表面的细菌与真菌群落，如苹果、蓝莓、猕猴桃、菠菜、莴苣等。也有文章研究了不同植物组织的微生物群落，如果实、叶子、花和根。结果显示，水果蔬菜表面的微生物群落与水果蔬菜本身的特征和生物过程有关。比如，不同葡萄品种上的细菌群落存在差异，而这些微生物群落的差异，可能会影响酿酒时的发酵效果。

此外，植物表面的微生物还可能与各种理化因子有关，最近的研究显示，菠菜与芝麻菜表面的微生物群落与其叶片表面的矿物质存在联系。植物根际的细菌群落或许也可用作土壤环境和矿物元素的检测。这些研究结果表明微生物—宿主或微生物—矿物质之间的联系非常广泛。

2.2 地理/环境因素和耕作方法的影响

在地理/环境因素方面，研究显示，许多环境因素均会影响微生物活动，包括温度、湿度、光照、土壤有机质和矿物组成。近期，人们对葡萄酒质量、葡萄微生物群落和区域气候之间的复杂关系进行了研究，结果显示葡萄上的天然微生物群落对果实的成熟和葡萄酒的发酵，尤其是一些与葡萄酒颜色和风味有关的次级代谢物的产生，均起着重要的作用。

在耕作方面，农业投入和诸如化肥、杀虫剂之类的耕作方法均会影响农产品上微生物群落的形成。比如，施肥便是影响玉米微生物群落的一个因素。有机农业和传统农业的土壤与产品（如葡萄、苹果、桃子、生菜和菠菜），有着不同的微生物群落。

2.3 储存和加工过程中的影响因素

冷藏是保持食物新鲜和营养的常用方法。在冷藏过程中，微生物的组成和活性会发生变化，比如：

刚采摘的苹果经过储藏后，曲霉属、葡萄孢属、毛霉属和青霉属真菌的相对丰度会增加；

菠菜在4℃或10℃贮藏15天后，表面的细菌多样性会下降；此外，对采摘后的果实进行物理或化学处理，也会影响其表面的微生物群落，比如：

1)伽马射线照射会改变长叶莴苣表面的细菌群落，并降低病原菌的存活率和再生能力；
2)高静水压处理，会改变整个细菌种群的动态活动，使甜樱桃和芦笋的保质期得以延长；
3)抗生素和杀菌剂能通过改变微生物群落，延长某些蔬菜水果的货架期；
4)次氯酸盐处理能改变细菌群落的结构，延长胡萝卜的保质期；
5)杀菌剂的应用改变了葡萄果实上酵母群落的动态变化。

总而言之，基于测序技术的水果蔬菜表面微生物群落研究，有利于提高蔬菜水果的采后贮藏质量。

总结

DNA测序技术的发展为微生物组研究和遗传分析提供了一种高效的方法和解决问题的手段，使微生物宏组学研究得到了很大的提升。遗传研究为微生物在遗传水平上的鉴定提供了DNA标记。这些标记广泛用于pCR或基于芯片的检测。在基于16S rRNA基因与ITS序列测序的基础上，宏组学方法是研究蔬菜和水果表面复杂微生物群落的重要方法。蔬菜水果表面的微生物群落，不仅受到植物种类和基因型的影响，与地理环境因素、耕作方法和采后处理等都有密切联系。由此可见，果蔬表皮微生物组研究，将从一个不同于传统研究的视角，为我们农业、果蔬种植贮藏、人体健康和疾病防治等领域的发展，提供更多有价值的信息！

文章索引：
Shen YM, Nie JY, Kuang LX, et al. DNA sequencing, genomes and genetic markers of microbes on fruits and vegetables[J]. Microbial biotechnology, 2020.

点击阅读原文：
https://sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/1751-7915.13560