客户成果丨影响因子23！环状RNA促进缺血性脑卒中动物模型的功能修复

近期，东南大学姚红红教授和中科院昆明动物研究所王建红副教授合作，在缺血性脑卒中病理机制研究方向发表了题为“Extracellular Vesicle-Mediated Delivery of CircSCMH1 promotes Functional Recovery in Rodent and Nonhuman primate Ischemic Stroke Models”的研究性论文。

论文中，作者首先应用Arraystar Human circRNA芯片筛选鉴定出与缺血性脑卒中预后相关的环状RNA分子circSCMH1，随后的研究发现circSCMH1能够影响神经再塑，促进损伤脑区的神经修复并减弱相应的炎症反应。机制上，circSCMH1通过与转录因子MeCp2结合调控MeCp2的细胞内定位从而影响缺血性脑卒中患者的预后。该研究成果发表在国际著名学术期刊Circulation (IF:23.054)上。（芯片实验由康成生物丨数谱生物提供技术服务）

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研究背景

缺血性脑卒中（Ischemic Stroke）是一种因血管阻塞导致局部或全脑功能障碍的脑血管疾病，是我国成年人致死和致残的重要原因。然而目前关于缺血性脑卒中的治疗药物很少能够改善脑卒中的长期预后。现在最常用的治疗方式为使用组织纤维蛋白溶酶原激活剂进行静脉溶栓，但是这一方法的治疗时间窗很窄，并且即使及时进行相应治疗也难以避免长期的神经损伤。因此对于如何减少脑卒中患者出现不良预后的相关研究具有很强的现实意义与研究价值。

环状RNA（circRNA）是一类将线性RNA分子的3’端和5’端通过反向剪切共价连接形成的环状RNA分子，可以由外显子、内含子或者同时包含这两种序列的片段组成。与线性分子相比，这种环形的结构可提高环状RNA的稳定性。环状RNA发挥功能主要有四种机制：1、环状RNA可以通过吸附miRNA发挥ceRNA机制。2、环状RNA可以结合特定的蛋白，调控靶蛋白的功能。3、某些环状RNA具有潜在的翻译能力，能够产生具有活性的短肽。4、环状RNA能够结合DNA影响基因的表达。

研究思路

为了研究影响脑卒中患者预后的环状RNA分子所发挥的作用，作者通过Arraystar Human circRNA芯片检测了缺血性脑卒中患者的血浆样本和正常人血浆样本中的circRNA的表达变化。作者重点关注了差异倍数（FC）大于2，p值小于0.05的cricRNA，进一步通过人和小鼠的同源性比对找到了在缺血性脑卒中患者体内表达下调的环状RNA分子circSCMH1。随后作者通过临床样本验证了circSCMH1在缺血性脑卒中患者血浆中表达下降，并且发现有不良预后的缺血性脑卒中患者体内的circSCMH1含量也较低。

为了研究circSCMH1的功能，作者构建了能将circSCMH1特异递送到脑组织的胞外囊泡递送系统RVG-circSCMH1-EV，据此在动物模型的脑组织中过表达circSCMH1。结果发现circSCMH1能够影响神经再塑，促进损伤脑区的神经修复并减弱相应的炎症反应。同时，小鼠以及短尾猿的行为学实验（如Grid-walking test）发现过表达circSCMH1能够促进实验动物损伤脑区功能的恢复。此外，体外利用慢病毒转染在神经细胞中过表达circSCMH1同样能够增加神经细胞树突的数量以及长度。

为了找到circSCMH1下游的作用机制，作者首先在神经细胞中过表达circSCMH1，通过RNA-seq检测了其与正常细胞间差异表达的基因，共找到了4010个差异基因。同时，作者也在神经细胞的细胞质中过表达了circSCMH1，通过质谱检测了过表达circSCMH1的神经细胞以及正常神经细胞两者细胞核内的差异表达蛋白，一共找到了73个细胞核中表达上调的蛋白以及123个表达下调的蛋白。通过这两个筛选结果再结合TRRUST-a数据库预测去寻找能够影响下游靶基因表达同时自身在细胞核中蛋白含量在过表达circSCMH1后有差异的蛋白，据此筛选出MeCp2。随后作者利用RNA pull-down以及RIp实验验证了MeCp2与circSCMH1的结合，并且通过细胞实验验证circSCMH1过表达会导致MeCp2在细胞质中的分布增多，促进MeCp2下游靶基因Mobp等蛋白的表达，从而增强神经细胞的修复能力。总体来看，circSCMH1作为一个与缺血性脑卒中预后相关的重要分子，对于缺血性脑卒中患者的治疗具有重要的现实意义。

技术路线

结果展示

图1. Arraystar Human circRNA芯片筛选结果及验证。A：差异circRNA的聚类图（FC≥2，p<0.05，n=3）；B：临床样本q-pCR验证circSCMH1差异表达（n=145）；C： 缺血性脑卒中患者不良预后组mRS(3-6)（n=61）与预后良好组mRS(0-2)（n=64）的circSCMH1含量比较。

图3. CircSCMH1机制研究。A：RNA-seq分析过表达circSCMH1后细胞中差异表达基因；B:LC-MS分析过表达circSCMH1后细胞核中蛋白差异表达情况（FC>2，p<0.05）；C：RNA-pull-down证明circSCMH1与MeCp2结合；D：过表达circSCMH1后MeCp2在细胞质中分布增加；E：MeCp2下游靶基因在过表达circSCMH1后表达上调。

研究意义

作者利用Arraystar circRNA芯片首次在缺血性脑卒中患者的血浆中找到了一种表达下调的环状RNA分子circSCMH1，随后的临床大样本研究证明了circSCMH1与缺血性脑卒中患者的不良预后显著相关。进一步的功能研究揭示了circSCMH1与神经细胞的修复有着重要关系，在动物模型中能够改善实验动物的预后情况。机制研究表明circSCMH1通过调控MeCp2的细胞内定位来发挥功能。总体而言，这项工作思路清晰，数据详实，对于环状RNA这一新兴领域的研究也使其具有了很高的科研价值。此外这一研究为缺血性脑卒中这一重大疾病的治疗提供了新的治疗靶点以及技术手段，对缺血性脑卒中患者而言具有很强的现实意义与临床价值。

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文章出处

Extracellular vesicle-mediated delivery of circSCMH1 promotes functional recovery in rodent and nonhuman primate ischemic stroke models. Circulation. 2020