重建修复受损组织之光;重建多层高密度光感受器细胞的超薄微模三维支架

聚合物支架是一种革命性的治疗方法，可以用于治疗影响视网膜外层的致盲疾病，视网膜是感受光线和形成视觉的主要器官，由不同层的细胞构成，分为视网膜外层和视网膜内层。最近的工程进展已经可以制备为支持单层视网膜色素上皮细胞驻留而优化的平面支架，目前正在进行早期临床试验。研究人员先前介绍过一个能支持极化单层光感受器细胞的三维支架，但光感受器细胞通常是多层密集的，以最大限度地提高光探测。在这篇文章中作者开发了一种适合于高密度光感受器细胞置换的生物可降解支架的制造。“冰立方托盘（ice cube tray）”结构优化了机械性能和细胞在生物材料上的驻留，能够制备出专为视网膜外层重建而设计的多层光感受器细胞。患有严重光感受器变性的患者有望从高密度光感受器细胞层构建中受益。这种方法也可以用于制备适合其他组织多层细胞构建的各种微观和纳米结构，用于其他组织的修复或者重建。

光感受器细胞(pRs)是一种光敏细胞，它捕捉光子，引发通过复杂神经网络的电化学脉冲，并最终赋予视觉功能。外视网膜退行性疾病和损伤的特征是原发性或继发性光感受器细胞丧失并导致严重的视力丧失。这些情况很常见，全球受影响人数超过千万人，是毁灭性的，不可逆转的，因为人类视网膜无法进行内在的自我修复。虽然基因治疗给一些患者带来希望，但它们的范围仅限于少数特定遗传性视网膜疾病(IRDs)患者，这些患者在病程早期就保留了足够数量的功能性原生视网膜光感受器细胞。获得性光感受器细胞障碍患者和处于IRDs晚期的患者不太可能从这些方法中获益。此外，遗传性视网膜疾病可能是由超过200种不同基因的突变引起的，这突出了单独使用基因或突变特异性策略治疗患者的困难。因此，广泛适用的恢复视力的方法，特别是细胞替换策略，非常有吸引力，因为它们有潜力覆盖广泛的患者群体，即使是在退化的后期。

干细胞生物学的进展和分化方案的扩大已经迅速地将细胞替代疗法推向了临床。眼睛和外视网膜疾病之所以成为首选，部分原因是与其他器官和组织相比，眼科手术干预的相对安全性、可行性、相对免疫豁免、有无创监测技术、具有以低细胞剂量提高视力的潜力。自第一个从人类多能干细胞(hpSCs)生成外视网膜细胞的三维培养方案提出以来，已经过去了12年，但该领域已经达到了一个重大的里程碑，已经启动了超过15个使用人类多能干细胞衍生的视网膜细胞的临床试验。所有主要的视网膜细胞类型都可以从hscs中生产，并模拟人类视网膜发育。由于光感受器细胞处于视觉功能的顶端，并且易受退化过程的影响，因此特别受重视。

体外视网膜细胞替代的第一个临床试验以分离细胞悬液注射人类多能干细胞衍生的视网膜色素上皮(RpE)细胞开始。这些1/2期试验揭示了该方法的缺点，包括注射时细胞反流和供体RpE在视网膜下腔(SRS，视网膜外层的光感受器细胞层和视网膜色素上皮(RpE)细胞层之间的潜在间隙)的混乱，导致较差的长期生存率和整合性。值得注意的是，细胞从视网膜下腔通过手术视网膜切开点回流到玻璃体腔也可能导致不良的结局，如视网膜前膜形成、增生性视网膜病变和视网膜脱离。为了应对这些挑战并促进更精确的细胞安置，迄今为止已经开发和研究了多种支架设计。三种hpSC-RpE平面支架，包括一种不可生物降解的对二甲苯膜，一种缓慢生物降解的聚对苯二甲酸乙二醇酯支架，和一种可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸静电纺丝支架，目前正在对年龄相关性黄斑变性(AMD)患者的hpSC-RpE单层递送进行临床试验。这些研究的早期报告原则上支持将支架植入视网膜下腔的安全性和可行性，但这些支架仅限于可挽救的原生光感受器细胞患者。来自动物研究的越来越多的证据表明，与分离的hpSC-RpE细胞移植类似，大剂量注射hpSC-pRs在移植过程中经常会出现反流、细胞存活率差、结构紊乱和/或整合率低。

近年来，为了克服大体积细胞悬浮液注射所固有的问题，研究人员开发了可支持hpsc来源的神经视网膜细胞生长的固体多孔聚合物薄膜支架。尽管取得了这些进展，但这些支架所要解决的两个核心工程挑战——细胞的无序性和细胞有效载荷低/难以预测——在很大程度上仍未解决。本文作者早前开发了一种“葡萄酒杯”设计支架，成功地定向了单层单独间隔的hpSC来源的光感受器细胞。然而，这种设计不支持多层hpSC-pRs的紧密关联。在本文中，作者介绍了一种新的策略，设计一种“冰立方托盘”形状的支架，能够捕获高密度的光感受器细胞、具生物相容性和生物可降解性，以最大限度地提高细胞载荷，同时也减少了整体生物材料负担。具体来说，第二代支架由两层组成:(i)储层(即细胞捕获井层)，用于播种光感受器细胞， (ii)基层，有规律地放置通孔，以促进流体和营养物质的运输。储层被设计为具有足够的体积和高度(即长度/宽度/高度为29/29/25 μm)，从而能够在单个储层中捕获多个光感受器细胞。（在人类和其他脊椎动物的视网膜中，pR细胞体仅存在于外核层(ONL)，其厚度约为8 ~ 10个细胞核，高度约为30 ~ 50 μm，在健康的人类视网膜黄斑区，pR细胞密度从每平方毫米数万到数十万不等。）此外，为了促进细胞在井内而不是沿井壁顶部播种，他们设计了尽可能薄的储层壁宽(~3 μm)，同时保持结构完整性。同样，为了防止细胞(平均直径6 μm)从穿孔的基层中逸出，将通孔直径(~5 μm)减到最小。理想的支架厚度接近天然黄斑(~30 μm)，符合支架厚度小于50 μm可使种子视网膜神经细胞与宿主RpE相互作用的观点。

作者用人类胚胎干细胞系（WA09-CRX + / tdTomato）生成视网膜类器官，视网膜类器官分化为晚期，然后将视网膜类器官分解，以产生含有高百分比（60％到80％）荧光CRX + / tdTomato的细胞悬液-pRs。将层粘连蛋白包被的支架接种几种浓度的细胞悬液培养5天以评估生物相容性并确定实现最大支架携带容量所需的最小细胞数。共聚焦成像证实，在层粘连蛋白包被的pGS冰块托盘支架的各个孔中成功表达了多个CRX + / tdTomato表达的pR，并成功存活。最大支架承载能力可以通过在每个孔中以500万个细胞的浓度进行接种来实现。冰格托盘设计使细胞携带能力增加了3.4倍，有助于捕获多达三层细胞层（平均每孔2.6±0.7个细胞核层）的pRs多细胞层。分化的pRs表现出视锥蛋白特异的（视锥细胞抑制素； ARR3）和视杆特异的蛋白（NR2E3）。冰格托盘设计的细胞有效载荷容量大幅增加，其总体生物材料负荷减少。考虑到视网膜内细胞堆积，组织和极化的重要性，特别是在视锥细胞方面[Stiles-Crawford效应和Nyquist极限分别与视网膜外层的方向和视锥细胞的密度有关]，研究人员还检查验证了是否存在（i）光感受器外节（位于pRs内的专门的光检测结构）和（ii）定位于基底pR轴突末端的突触前囊泡。冰格托盘支架中pR极性的实质好处是支架顶部的供体pR轴突末端的暴露区域更大，该区域紧邻宿主中间神经元（即双极细胞）的树突状末端。 这样的取向不仅使供体-宿主突触界面处的屏障（在生物材料降解之前）最小化，而且将通孔定位在支架基底上，以允许供体pR与宿主RpE和脉络膜之间的流体和物质交换。支架会随着时间的推移而降解。它还将大部分生物材料体积集中在宿主RpE附近，宿主RpE是在SRS内的支架降解中起着重要作用的细胞层，可能是由于细胞外基质重塑基质金属蛋白酶的分泌。后继将集中于动物实验，令人期待。