Takara来支招，如何确定慢病毒/逆转录病毒前病毒整合位点！

时间：2021-08-03 00:00:00 来源：网络整理

慢病毒和逆转录病毒载体在生命科学研究领域，作为向目标细胞导入外源基因的有力工具而得到广泛应用。通过它们的复制生命周期会将慢病毒和逆转录病毒RNA基因组的一个DNA拷贝整合到宿主基因组中。利用这一特点，可以实现外源基因在目标细胞中的持续稳定表达。

而整合位点位置对转基因的表达和宿主细胞的表现型都有重要影响，甚至可能会导致关键基因突变或者激活原癌基因，进而导致发生恶性肿瘤的风险增加。在2021年2月国家发布试行的《基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则》中，描述了基于临床安全性考虑需要对一些整合性载体，包括如慢病毒、逆转录病毒，所可能带来的插入突变风险进行评估。

成熟的整合位点分析技术

Takara可分别提供适用于慢病毒和逆转录病毒前病毒整合位点分析试剂盒，使用基因组步移技术获取慢病毒/逆转录病毒前病毒在转导细胞基因组中的整合位点片段，后续对扩增产物进行测序和分析，可以确认整合位点所处的染色体位置。

产品名称

Code No.

适用病毒类型

Lenti-X™ Integration Site Analysis Kit

631263

慢病毒

Retro-X™ Integration Site Analysis Kit

631467

逆转录病毒

我们来看一下HT1080细胞克隆中慢病毒整合位点的分析结果。

提取慢病毒整合后的HT1080细胞基因组DNA，使用DraI、SspI、HpaI这3种不同的平末端切割限制酶酶切消化基因组DNA并连接接头，构建出3个病毒整合文库。这3个病毒整合文库经过两轮pCR扩增后，对获得的5个扩增产物进行纯化，并分别使用试剂盒中包含的Ap2和LSp2接头引物测序和BLAST软件分析。分析结果显示，其中4个pCR产物对应的整合位点为染色体12q22。染色体12q22上的病毒整合位点位于NR2C1基因的内含子内。