《Nature Biotechnology》RNA编辑达到了一个新水平！

遗传疾病的治疗一直是一个亟待解决的难题。

幸运的是，随着人类基因组学的发展，越来越多的人类遗传疾病基因被陆续发现。

通过改变遗传疾病患者的基因序列，从根本上治愈人类遗传疾病，已成为一种很有前途的治疗方法。

最近，各种可编程的、特定位点的基因信息处理工具的开发，为纠正致病基因突变创造了机会，如David Liu等人开发的DNA碱基编辑器。

然而，值得注意的是，DNA编辑可能导致遗传和永久的脱靶突变，这极大地限制了DNA碱基编辑器在人类中的应用。相比之下，RNA编辑只会瞬时改变mRNA，从而避免了安全和伦理方面的担忧。

最近，德国Tübingen大学Thorsten Stafforst教授团队在《自然生物技术》杂志上发表了一篇题为《CLUSTER guide RNAs enable precise and efficient RNA editing with endogenous ADAR enzymes in vivo》的研究论文。

本研究开发了一组导向RNA，即gRNA簇，它们以多价方式结合靶mRNA而不需要外源蛋白质，利用内源性ADAR酶实现高精度和高效率的编辑，并能够对gRNA设计无法实现的先前序列进行有针对性的编辑。

在细胞实验中，CLUSTER gRNAs的编辑效率高达45%，在小鼠实验中，CLUSTER gRNAs的编辑效率也高达10%。

RNA碱基编辑是基因组编辑的一个很有前途的选择。目前，已经设计了几种RNA编辑工具来靶向腺苷-肌苷(A-to-I)和胞苷-尿苷(C-to-U)的转变。

这些RNA编辑工具需要一种工程编辑酶的异位表达，可能导致大量的脱靶编辑。

事实上，高度活跃的A-to-I编辑酶的异位表达导致了这种疾病的脆弱小鼠模型的致命后果。

基于此，越来越多的研究利用内源性RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)来解决工程编辑酶的异位表达问题，但仍存在序列限制、编辑效率低、编辑脱靶等问题。

早在2016年10月，Stafforst教授团队就发表了核酸研究中使用内源性ADAR编辑RNA的相关研究。

这篇文章的标题是:利用人类ADAR2修复RNA——对pINK1突变进行编码拯救线粒体吞噬（Harnessing human ADAR2 for RNA repair – Recoding a pINK1 mutation rescues mitophagy）。

研究小组设计了一种特殊的gRNA，它包含与目标序列结合的补体，以及招募ADARs的RNA结构基序。

当这些gRNAs以化学修饰寡核苷酸的形式使用时，设计尤其成功，对STAT1等相关转录本产生20-30%的编辑量。

值得注意的是，研究人员发现相同的寡核苷酸序列在质粒中表达时效果要差得多。

一种可能的解释是化学修饰的寡核苷酸具有更强的结合亲和力。

因此，当特异性域扩展超过100 nt时，质粒携带的gRNAs成功地通过内源性ADARs编辑内源性靶标。

Thorsten stafford将这些gRNAs称为LEApER gRNAs，然而，LEApER方法显示了大量的脱靶编辑，因为较长的gRNAs更容易与脱靶mRNA结合。

因此，该研究团队对其进行了改进，并描述了新的CLUSTER gRNAs的设计原则——包括一个与靶mRNA结合的特异性域和一组7-20nt招募序列(RS)，以及ADAR的招募序列(RS) RNA结构基序。

这种CLUSTER设计使基因编码的gRNA具有高度的序列灵活性，能够以多价方式与其目标mRNA结合，实现高精度、高效率的编辑，并能够靶向使用以往gRNA设计无法达到的序列。

CLUSTER gRNAs可以通过基因编码和病毒载体传递，在多种细胞系中实现高效编辑。

在细胞培养中，CLUSTER gRNAs能够靶向编辑内源性转录本，效率高达45%。

在体内，通过流体动力尾静脉注射(HTVi)将CLUSTER gRNAs注入小鼠肝脏，可导致高达10%的编辑报告基因构建。

综上所述，本研究开发了一种CLUSTER gRNAs，可招募内源性ADAR酶进行RNA编辑，具有更高的编辑效率和更少的脱靶效应。

CLUSTER方法为RNA碱基编辑领域的药物开发开辟了新的途径!

参考:https://www.nature.com/articles/s41587-021-01105-0