香港城市大学PNAS：新研发CRISPR-Cas9蛋白提高基因编辑技术精准度

由香港城市大学（香港城大）和瑞典卡罗琳医学院合组的一支研究团队，最近成功研发出一种新的蛋白质，有助提高基因组编辑过程中定位的精准度，相信对未来要求高精准度的人类基因治疗可发挥重要作用。

CRISpR-Cas9（成簇、规律、间隔、短回文的重複序列及其相关蛋白9）是一种具有广泛应用前景的基因编辑技术，可用于治疗多种遗传病和开发抗旱农作物等，而使用CRISpR-Cas9治疗癌症、血液病和眼疾的临床试验亦正在进行。

原位修复遗传缺陷

CRISpR-Cas9使修改或编辑基因变得非常简单，因而被公认为强大的基因编辑工具。传统的基因疗法是将额外的正常基因引入细胞，而CRISpR-Cas9的不同之处，在于透过移除或纠正有问题的DNA（脱氧核糖核酸），恢复正常的基因功能，原位“修复”遗传缺陷。

在基因编辑的过程中，Cas9酶负责在进行修改之前，要在整个浩瀚的基因组中搜索并锁定有问题的或待编辑的目标DNA片段（可谓超过亿裡挑一的难度），称为基因靶向定位。但有时靶向定位可能不够精准，可能会在基因组非目标的位置修改了DNA，造成脱靶编辑。这种基因组意外改变有机会导致严重的后果，如引发癌症，就像多年前最初进行基因治疗试验时出现的情况。因此，要令CRISpR-Cas9能够对基因组进行精准的“分子手术”，是非常重要的。

现时CRISpR基因编辑技术中常用的Cas9酶有两种版本：SpCas9（来自化脓性链球菌的Cas9核酸酶）和SaCas9（来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶）。在一定程度上，两者会出现不精准或出现脱靶效应（即偏离目标）的情形。先前研究人员已改良了SpCas9，设计出SpCas9变体，提高其靶向精准度。可是，这种SpCas9变体的体积太大，不易被装入常用于传递体内基因治疗、而容量细小的腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体中。

相反，SaCas9的体积比SpCas9小得多，很容易被装入负载能力有限的AAV载体中，以便在体内传递基因编辑的分子手术刀。然而，至今仍未有基因组靶向准确性高的SaCas9。

SaCas9-HF变体大幅提高全基因组靶向精准度

由香港城大生物医学系兼卡罗琳医学院刘鸣炜复修医学中心助理教授郑宗立博士，以及香港城大生物医学系助理教授史家海博士领导的研究团队，针对普通SaCas9靶向定位不够精准的问题，最近成功开发出一种CRISpR SaCas9变体，名为SaCas9-HF，能在人类细胞全基因组内精准靶向定位，而不会影响在目标位置的编辑效率。

研究团队对比野生型（即未经变异）SaCas9和新型SaCas9-HF的性能，针对24个人类基因位置进行了严格的测试。他们发现，对于在基因组中具有高度相似序列的目标基因位置，野生型SaCas9因而容易编辑脱靶，SaCas9-HF则将脱靶效应降低约九成；对于野生型SaCas9较少出现编辑脱靶的目标基因位置，SaCas9-HF则几乎无法检测到脱靶的情况。

SaCas9基因组编辑应用的替代方案

“我们研发出SaCas9-HF，成为野生型SaCas9的替代方案，能在要求高度精准的基因编辑时应用。这种新型的SaCas9对于未来使用AAV载体在体内传送基因组编辑『药物』或称为『分子手术刀』的基因疗法特别有用，并将可与最新研发、能够『搜索并替换』目标基因的CRISpR平台『先导编辑』（prime editing）相容。”郑博士说。

此项研究结果早前在《美国国家科学院院刊》（proceedings of the National Academy of Sciences，pNAS）上发表，题为“Rationally engineered Staphylococcus aureus Cas9 nucleases with high genome-wide specificity”。史博士和郑博士是论文的通讯作者，香港城大生物医学系博士生谭元燕和刘鸣炜复修医学中心高级研究助理Athena H. Y. Chu博士是共同第一作者。

其他研究团队成员包括香港城大生物医学系助理教授熊文君博士、研究助理鲍思羽（现于刘鸣炜复修医学中心任职）、博士生Hoang Anh Duc和Firaol Tamiru Kebede，以及中山市人民医院季明芳教授。

此项研究获得香港城大、刘鸣炜复修医学中心、国家自然科学基金委员会、瑞典研究理事会、香港政府创新及科技基金、香港医疗卫生研究基金、香港研究资助局、深圳市科技创新委员会以及深圳市医疗卫生三名工程的支援。

原文标题：

Rationally engineered Staphylococcus aureus Cas9 nucleases with high genome-wide specificity