PacBio SMRT测序协助科学家追踪SARS-CoV-2病毒起源

随着COVID-19的不断传播，纽约成为了近一段时间以来的疫情震中。究竟纽约市的新型冠状病毒源起何方，成为了相关研究人员关注的重要问题。而运用高准确度的SMRT长读长测序技术则能够通过发现病毒基因组中包括单碱基在内的变异来对病毒传染的脉络进行溯源。

位于纽约市的西奈山医院，是纽约市*大的学术医疗体系。近日，由西奈山伊坎医学院（ISMMS）的研究人员牵头，采用pacBio SMRT测序技术，通过对84个病人的90个SARS-CoV-2病毒样本进行分子流行病学分析，确认纽约市早期确诊的COVID-19病例主要来自欧洲地区。这一研究也是**个追踪这些病例来源的研究，并表明纽约市的流行病毒主要来自于美国与欧洲之间的无追踪传播而引起的。目前有限的证据还无法支持病毒从中国或亚洲地区直接传入。并且，也追踪到了病毒早期的在纽约发生的社群传播。近日，这篇文章已经发表在了预印网站medRxiv上。

冠状病毒基因组为线性单股正链的RNA病毒。相对于DNA病毒，RNA病毒往往具有更频繁的变异。如何区分整个基因组中可能只有少数SNV不同的变体来进行深入研究？必然需要依赖于更准确的基因组碱基序列信息。而在满足高精度要求的同时，只有pacBio SMRT测序技术能提供的更长读长范围。

目前在新型冠状病毒*大的数据库GISAID上，已经分享了来自不同国家运用各种测序技术的新冠病毒基因组组装结果。然而，通过比较，可以发现，相当一部分的结果连续性较差，并且基因组中依然还有大量未知的区域存在。可想而知相关的分析也会受到限制。

从组装的连续性，以及未知序列的大小上看，GISAID上相当一部分SARS-CoV-2的组装结果很差。

不过，*新的数据表明，来自pacBio测序技术的结果，能够很好的呈现出准确而连续的病毒基因组组装结果。

借助pacBio长读长测序技术，采用长扩增子的策略，避免了由短扩增子引起的病毒基因组中容易出现的gap，从而可以获得更加完整的病毒基因组。

在本文中，作者所采用的技术策略为，首先对样本中RNA进行随机反转cDNA，随后通过重叠范围在200bp的瓦片叠加的引物对SARS-CoV-2的全基因组进行扩增，生成带有barcode信息的1.5-2 kb扩增子。在后续的SMRTbell文库构建环节，连接Overhang SMRTbell adapters形成文库后，在Sequel系统上进行测序。

后续，通过CCS read方式，获得质量在Q20（with>3 passes）以上的序列进行参考基因组比对，*终获得高准确度的不同病毒样本的全基因组组装结果。随后通过SNp进行进化树分析。

作者对来自3月18日前确诊的84个病例中，不同临床取样的90个SARS-CoV2病毒样本进行进行全基因组测序，生成了72个完整的全基因组以及18个部分（>95%）的基因组序列。通过系统进化树进行系统分析，发现早期纽约市流行的SARS-CoV-2有87%是来自于A2a 分支，而这一分支有72%的病例主要来自欧洲。因此也就说明了纽约市在早期流行的病毒主要来自于美国与欧洲之间的无追踪传播。此外，结合流行病学调查，基因组分析的结果也显示了在2020年3月18日之前，SARS-CoV2在纽约市的社区传播。

通过病毒全基因组的高质量测序结果，可以对病原体进行精确监控，从而使研究人员可以推断出病原体进入社区的来源和时间。结合目前共享的成千上万的SARS-CoV-2序列，以及西奈山伊坎医学院开展的病原体监测计划，可及时生成在西奈山卫生系统中寻求治疗的众多不同患者群体中病原体的高分辨率遗传信息。并将这些数据整合到临床操作中，以支持研究和临床护理。

在这篇文章中，作者分享了有关SARS-CoV-2全基因组扩增的有关引物序列，供全世界进行此次疫情相关研究的科学家们参考。另外，近期pacBio官方分享了有关使用pacBio进行COVID-19研究的相关信息。更多COVID-19相关信息请访问我们的COVID-19 Sequencing Resource Center，以查看*新的测序方案，引物信息和相关文献。

参考文献：
Introductions and early spread of SARS-CoV-2 in the New York City area .
medRxiv 2020.04.08.20056929; doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.08.20056929

基因有限公司作为pacBio公司在中国区的独家代理商，自2011年以来将pacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的pacBio用户。