腺相关病毒在基因治疗中的研究进展与展望

前言

基因治疗是目前最热门的治疗领域之一，因为它针对的是疾病的潜在原因，而不仅仅是症状。该疗法可诱导病变细胞基因表达或沉默，已在临床前试验中取得成功，但其临床应用仍受基因载体的免疫原性、致癌性、脱靶效应和疗效等因素的限制。

基因治疗成功的一个关键考虑因素是用于传递治疗性核酸以表达或沉默基因的载体。重组病毒已被用作基因治疗载体，在细胞摄取、基因整合和基因长期表达方面，特别是在机体内更有效，但具有免疫原性、潜在的致癌作用和繁琐的制造工艺。

为了解决这些局限性，人们开发出了能够避免免疫反应、适应性强、质量可控的非病毒载体，但转染效率低，易导致转基因被动表达。

腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)在基因治疗领域的发展势头日益强劲，越来越多的临床试验将其用于各种治疗。截至目前，fda批准的基于aav的基因疗法包括Sparktherapeutics的Luxturna和Avexis的Zolgensma，分别用于治疗遗传性视网膜疾病和脊髓性肌肉萎缩。

AAV由于其较低的免疫原性和位点特异性整合能力，被认为具有较好的安全性。然而，针对AAV的中和抗体在大多数人体内普遍存在，限制了AAV的系统性应用。

目前人们的研究主要集中在工程化AAV，通过对其衣壳进行分子修饰，与小分子和聚合物偶联、络合，并包装在各种人工和天然载体(包括囊泡、水凝胶和聚合物)中，用于提高安全性、有效性和多模式处理。

利用AAV载体的临床试验结果也强调了开发有效、安全、通用的载体对实现理想的基因治疗的关键作用。

AAV的历史和病毒学

AAV最早发现于20世纪60年代，被认为是腺病毒培养的污染物。然而，随着AAV只能在腺病毒存在下复制的发现，以及后来单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的存在，腺病毒和AAV之间的联系很快建立起来。在确定AAV能转化哺乳动物细胞后，研究人员开始生产重组AAV (rAAV)。含腺病毒DNA的质粒可以独立于辅助病毒复制AAV。这一发现推动了该领域的发展，真正打开了AAV的基因治疗领域。

AAV是一种小型无包膜细小病毒，基因组大小约为4.7kbp，衣壳长度为20 ~ 25nm。该基因由复制(REp)和衣壳蛋白(CAp)两个编码区组成，并在基因组两端存在反向重复序列(ITR)。REp编码与感染、整合、复制相关的4个蛋白Rep40、Rep52、Rep68、Rep78, CAp编码Vp1、Vp2、Vp3 3个蛋白，分别构成AAV的60-，比例为1:1:10。mer衣壳。Vp3最为丰富，构成外壳结构的外部，Vp1和Vp2构成外壳结构的内部。

AAV不能独立复制。只有当辅助性病毒(如腺病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒)存在时，才能进行复制和溶细胞感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。AAV将其基因组整合到第19号染色体AAVS1上的一个特定位置，或者在染色体外独立复制。AAV是非致病性的，即使在自然状态下也不会引起任何疾病;此外，它没有系统性的先天免疫反应。共发现12种天然AAV衣壳血清型，命名为AAV1-AAV12，表现出优先结合体内特定组织的特点。

AAV不仅可以感染活跃分裂的细胞，也可以感染静止的细胞，这使得它对许多病毒和非病毒载体对基因传递不敏感的细胞群特别有价值，如视网膜细胞和神经元细胞。AAV感染静止细胞的天然能力为基因治疗带来了许多重大进展，例如Luxturna (Spark Therapeutics)被FDA批准用于治疗莱伯氏先天性黑蒙。

临床批准的基于aav的基因治疗药物

在过去的20年里，基于AAV载体的治疗在临床转化中的相关性不断提高，目前占全球基因治疗临床试验的8.1%。

第一个在欧洲批准临床使用的基于aav的基因治疗药物是脂肪基因tiparvovec (AT)，用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症(LpLD)，一种罕见的常染色体隐性疾病。该药物于2012年获得批准，商标名为Glybera。AT基因治疗提供了LpL基因的一个变体LpLS447X，用于纠正LpL患者的LpL功能。在一项III期临床试验中，服用AT 14周后，低脂饮食后乳糜微粒的峰值水平降低了79%。

目前有17种基因疗法获得了美国FDA的批准，包括由Spark Therapeutics于2017年以Luxturna商标开发的AAV载体voretigene neparvovec rzyl (VN)。VN包含一个包裹RpE6基因的AAV2, RpE6基因用于治疗与rpe65相关的双等位基因视网膜营养不良，这是一种罕见的遗传疾病，导致视觉功能受损，随着年龄的增长而衰退，最终导致失明。在2012年进行的一项III期临床试验(NCT00999609)中，Leber先天性黑蒙2型患者接受视网膜下注射VN 1年后，65%的参与者获得了最大的改善。在VN被批准之前，没有治疗视网膜营养不良的药物。

2019年获FDA批准的第二种基于aav的基因疗法是Onasemogene abeparvovec xioi (OA)，由AveXis开发，商品名为Zolgensma。OA使用表达功能性SMN1转基因的AAV9治疗2岁以下儿童的I型脊髓肌萎缩(SMA1)。SMA1的特点是脑干和脊髓运动神经元缺失，导致运动功能严重受损，最终因呼吸衰竭而死亡。它是导致婴儿死亡的最常见的单基因遗传病。在2017年一项名为STR1VE (NCT03306277)的III期临床试验中，治疗后，91%的患者在14个月时仍不需要永久性呼吸支持，50%的患者在18个月时能够独立坐着。下表列出了正在进行和即将进行的基于AAV的临床试验。

AAV治疗干预策略的应用

最常见的aav介导的治疗干预是基因置换，其特点是引入功能基因副本治疗单基因疾病。该方法主要用于罕见和不可治疗的疾病，是上述两种fda批准的AAV基因治疗的基础。另一个值得注意的基因替换的例子是正在进行的治疗严重血友病A的临床试验，这是凝血蛋白因子VIII缺乏。这是一种隐性x连锁疾病。在美国，三分之一的病例可能是由自发突变引起的，在美国，每5000个新生儿中就有1个发生这种情况。在使用AAV治疗血友病A的临床试验中，有3个预计将于2020年底或2021年初开始III期临床试验(NCT04323098、NCT04370054、NCT03734588)。

基因添加是AAV基因治疗应用最广泛的一种，因为它可以用于治疗较常见的非单基因复杂疾病，如慢性、自身免疫性或感染性疾病。使用AAV进行基因添加的例子包括正在进行的治疗类风湿性关节炎的临床试验。目前，Arthrogen正在进行1期临床试验(NCT02727764)。AAV载体携带IFN-β转基因，IFN-β是一种抗炎介质，在骨骼和软骨保护中发挥作用。

与试图克服功能缺失突变的基因替换不同，基因沉默，也被称为RNA干扰(RNAi)，可以用来抑制有害的功能获得突变。在这种方法中，AAV转基因编码一个miRNA前体，该前体经靶细胞自身的RNAi机制加工产生miRNA，这是一个小的非编码RNA链，可以与mRNA对中的互补序列建立碱基，以抑制其表达。利用AAV进行基因沉默的大多数努力仍处于临床前研究阶段，因为沉默有几个必须解决的具体安全问题。一个主要问题是非目标沉默的可能性。另一个问题是RNAi饱和的机制。在这个机制中，转基因miRNA的表达可能压倒并破坏内源性miRNA的产生，导致细胞毒性。目前，unique已经开始了一项使用AAV基因疗法治疗亨廷顿舞蹈病的临床试验(NCT049493)。

AAV应用的挑战

大多数成功应用于临床前和临床研究的AAV限于天然衣壳血清型，但这些AAV血清型的广泛临床应用具有明显的局限性。针对AAV的中和抗体的存在仍然是全身输送的重要障碍。

这些中和抗体干扰AAV进入靶细胞、细胞内运输和在细胞核内拆封，从而阻止转导。为了更好地了解AAV暴露产生的免疫反应，已有研究对产生的IgG亚类进行检测，发现主要是IgG1。

流行病学研究表明，在30-60%的人群中可发现不同血清阳性率的中和抗体。这些中和抗体中最常见的是AAV2，其次是AAV1。

aav介导的基因治疗的另一个问题是，包括itr在内的基因组的大小限制(4.7kbp)，只留下了~ 4.5kbp大小的空间，使转移基因的靶向指标仅为“是转基因小片段的表达”。

工程AAV

可以通过衣壳修饰、表面偶联和封装来设计AAV，解决天然AAV的局限性。

AAV工程的共同目标是避免全身给药后血液循环中的中和抗体失活。通过修饰中和抗体的衣壳结合位点来防止中和是一种很有前景的方法。然而，其中许多位点对AAV的转导至关重要，因此在不损害其功能的情况下对其进行修饰是一项挑战。此外，使用聚合物、脂质和水凝胶的表面栓系和包封可以保护AAV衣壳免受nAbs的攻击，使其逃避免疫系统和抗体反应的检测。

AAV工程的另一个好处是通过结合组织特异性配体到衣壳、表面偶联和包封材料来提高靶向传递和激活。从包装材料(如孔隙大的硅颗粒)中被动释放aav可以延长生产周期和交货时间。对外部和内部刺激(如光线、pH变化或酶降解)做出反应的材料允许AAV在靶组织或细胞类型中被释放或激活，而磁颗粒结合的AAV通过施加磁场指向目标。

工程AAV还可以用于克服基因组大小的限制，并将多种治疗方式结合在一起进行多模式治疗。疾病细胞突变途径中的多个基因可以通过传递两个基因重新编程，一个通过AAV，另一个通过表面偶联或封装的AAV载体中的第二个核酸;生长因子通过基因激活和结构支持促进组织再生;联合给药与AAV同时干扰异常活动并重组病变细胞，从而产生协同治疗作用。

前景

随着全球市场临床批准产品的出现和越来越多的成功临床试验的开展，AAV处于基因治疗的前沿，但其较小的基因组和中和抗体限制了其在许多疾病中的应用。

工程AAV可以解决这些问题，同时提供额外的好处，包括可控和刺激反应释放、扩大组织定向和多模式运输。多模式工程AAV解决了AAV和单模式基因治疗的局限性，因为它们不仅扩大了治疗潜力，而且可以协同作用于疾病本身的多个方面。

目前正在探索的结合第二种治疗方法的工程化AAV是基因治疗的一个尚未开发的领域，它可以超越传统的单模基因传递系统。虽然进一步的技术进步还需要更多的临床试验来验证，但多模态工程AAV在未来的基因治疗中显示出了广阔的前景。