荧光显微镜显示活细胞如何形成囊泡运输生长因子

细胞有一种聪明的方式来运输像生长因子这样的物质通过细胞膜进入细胞。这被称为网格蛋白介导的内吞作用。网格蛋白的分子聚集在细胞膜的内部，它们使细胞膜变形，从外面看就像一个坑。

当它装满货物后，凹坑会收缩，在细胞内形成一个被网格蛋白包裹、被膜包裹的囊泡，然后继续向正确的目的地前进。在培养的细胞中，每分钟可以形成数百个这种网格蛋白包覆的囊泡。

然而，关于这些小泡如何组装的模型存在冲突，这留下了一个关键的知识空白。一种模型是常曲率模型，曲率是在网格蛋白聚合的同时诱导的。另一种是平面到曲面的转变模型，该模型认为网格蛋白分子的平面晶格首先在细胞膜内部组装，然后发生构象变化，形成网格蛋白包裹的坑和囊泡。

这两种模型的证据都可以通过电子显微镜看到——但这些是固定细胞的静态快照，不能揭示实际的纳米尺度动力学和网格蛋白介导的内吞作用的可能途径。

现在，阿拉巴马大学伯明翰分校和埃默里大学的Alexa Mattheyses和他的同事们正在利用一种名为STAR显微镜的复杂荧光显微镜成像技术来填补这一知识空白。这使得他们能够跟踪活细胞中网格蛋白包膜囊泡的形成，从开始到完成，时间长达100秒。

他们的研究发表在《自然通讯》杂志上，支持所谓的网格蛋白包被囊泡形成的柔性模型，该模型包括常曲率和平面到弯曲的过渡路径。

“我们发现，在较短寿命的网格蛋白包被囊泡中，网格蛋白的积累优先与曲率的形成同时发生，但在较长寿命的网格蛋白包被囊泡中，网格蛋白的积累倾向于从平面到弯曲的转变，”UAB细胞、发育和综合生物学系副教授Mattheyses说。“总之，我们的结果提供了有利于内吞作用灵活模型的实验证据，其中单一的曲率形成模型不能包含细胞介导的内吞动力学的异质性。”

同时双波长轴向比，或STAR，显微镜是基于全内反射荧光，或TIRF，显微镜允许观察荧光标记蛋白在质膜或接近，距离约100至200纳米。在STAR显微镜下，蛋白质被标记为两个激发波长不同的荧光团，以利用倏逝场的波长依赖性穿透深度。其结果是一种同时解决蛋白质积累(通过荧光强度测量)和与质膜的距离(通过两个荧光团的荧光强度比测量)的能力。在目前的研究中，这个代表纳米z分布的距离是曲率的量度。

利用猴子肾成纤维细胞，Mattheyses和同事用荧光团标记网格蛋白CLCa轻链，激发波长为488和647纳米。然后，他们用表皮生长因子刺激细胞，诱导内吞作用。使用UAB Cheaha超级计算机进行定量分析，13个细胞产生了1,948个CLCa-STAR累积。

他们发现了三种曲率起始模型的证据:成核，在网格蛋白出现前不到一秒曲率就开始形成;恒定曲率，在网格蛋白到达一到四秒后曲率开始形成;以及平面到弯曲的转变，在网格蛋白积累超过四秒后弯曲开始。

为了进一步分析数据，研究人员根据网格蛋白寿命和囊泡形成模型对内吞事件进行了分组。这揭示了一些有趣的特征。

“我们发现，少于20秒的短期内吞作用主要是通过常曲率模型形成的，而超过20秒的较长时间内吞作用有利于从平面到弯曲的转变，”Mattheyses说。“成核事件的比例更小，更倾向于短期事件。”

为了验证这种网格蛋白介导的内吞作用的灵活模型在不同细胞系之间是否具有普适性，研究人员还成像了人脐静脉内皮细胞，通过血管内皮生长因子刺激来刺激内吞作用。他们发现了类似的内吞事件范围。

“这些数据显示了之前未被认识到的网格蛋白介导的内吞动力学的异质性和网格蛋白包被囊泡形成的可塑性，它们表明不同的细胞类型或物质可以利用这种灵活性来影响曲率形成的模式，”Mattheyses说。“未来使用STAR显微镜的研究将确定辅助蛋白的招募和生物物理参数在囊泡形成中的作用，以及不同的网格蛋白动力学如何影响信号传导和细胞内稳态。”

该研究“成像囊泡形成动力学支持网格蛋白介导的内吞作用的灵活模型”的共同作者是Tomasz J. Nawara, Yancey D. Williams II, Tejeshwar C. Rao和Elizabeth Sztul, UAB细胞，发育和整合生物学部门;以及来自乔治亚州亚特兰大埃默里大学化学系的胡月松和Khalid Salaita。

2015年，Mattheyses和Salaita在Emory共同开发了STAR显微镜。Mattheyses自她在密歇根大学与Daniel Axelrod博士(许多人认为他是这项技术的先驱)一起工作以来就一直在研究TIRF显微镜。

文章标题Imaging vesicle formation dynamics supports the flexible model of clathrin-mediated endocytosis