神奇分子机器：可见光触发分子机器机械穿孔细菌治疗感染 耐药性不再

抗菌素耐药性 (AMR) 是人类面临的最大挑战之一，有资料显示目前每年造成 700,000 人死亡。仅耐甲氧西林金黄色葡萄球菌这种皮肤和软组织感染的常见原因，在2019年估计造成了10多万人死亡。预计到 2050 年，全球每年将有 1000 万人面临耐药性感染的风险。但新抗菌剂的开发进展缓慢。全球迫切需要开发安全有效的新型抗菌剂，以限制细菌耐药性的上升，同时保持现有抗生素的活力。

合成的分子马达或分子机器 (MM) 是一些可以响应刺激以受控方式单向旋转，从而产生机械作用的分子结构，是纳米研究领域的重点。2016年Bernard Feringa因此成为诺贝尔奖得主。分子机器的动力来源主要有化学驱动、电驱动和光驱动，光因其非化学和非侵入性以及易于控制而特别有吸引力。合成 MM 由定子和光激活转子组成。照射后，分子经历连续的单向旋转，导致类似钻孔的快速（≈3 MHz）运动，可以推动它通过脂质双层。MM 在多种应用中显示出巨大的前景，从药物输送到化学和抗菌治疗。然而，过往依赖紫外线 (UV) 辐射进行激活限制了先前开发的 MM 的临床应用，由于这些波长对哺乳动物细胞的有害影响。

莱斯大学的化学家James Tour和他的团队最近成功地测试了六种不同的、由可见光（405nm）驱动的分子机器，它们都能在短短两分钟内在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的细胞膜上穿孔而快速杀死细菌。对于那些对机械入侵没有天然防御能力的细菌来说，抵抗是徒劳的。这意味着对标准抗菌治疗产生耐药性的细菌也不太可能产生耐药性。MMs 代表了一种独特的刺激激活抗菌疗法，其机制基于分子尺度的机械作用。这种独特的作用机制不同于任何其他抗菌化合物，并且不太可能产生对 MM 的耐药性。这项突破性研究由Tour和Ana Santos和Dongdong Liu领导，发表在《科学进展》杂志上。

由于长时间暴露在紫外线下会对人体造成伤害，研究人员多年来一直在改造这种分子。他们合成了一个包含 19 种由405纳米的可见蓝光激活的MM 的库，通过将胺或烷氧基供电子取代基引入 MM 的共轭核心实现可见光活化，在分子的定子或转子部分用不同的胺进一步修饰分子，以促进 MM 的质子化胺与带负电荷的细菌膜之间的结合。

该 MM 库最初是在大肠杆菌BW25113 中进行抗菌活性筛选的。将大肠杆菌细胞悬液与一系列浓度（0.3125 至 40 μM）的不同 MM孵育，然后用 405 nm 光照射 5 分钟后培养检查样品的生长情况。光激活 MM 的最小抑制浓度 (MIC) 定义为在指定 强度的405 nm 光照射后没有可见细菌生长的 MM 浓度。分析表明MM旋转速度快对MM的抗菌特性的重要性，分子在膜内的方向和定位的差异，以及它们在光激活后旋转方式的后续差异，可能会影响它们施加的膜变形程度，从而解释它们不同的抗菌活性。

在其他革兰氏阴性和革兰氏阳性菌株中进一步研究了MM的杀菌潜力。光激活 MM 的杀伤作用以浓度和光强度依赖性方式变化，增强的 MM 浓度和光强度导致更高的 MM杀伤。在不同光照强度和不同浓度下MM均能有效杀死耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌。在连续传代实验中反复暴露于 MM 并不伴随 MIC 值的变化，表明不同细菌对 MM 治疗产生耐药性的倾向较低。

由于无法分离 MM 抗性突变体，因此使用通过 RNA-seq 的基因表达分析、一系列分光光度法和分光荧光法以及大肠杆菌中的电子显微镜来研究这些新分子的作用机制。这些结果表明，MMs 的作用方式与膜靶向、穿孔素抗生素（如乳链菌肽或达托霉素）不同，MM 诱导的抗菌作用可归因于光激活后 MM 的快速钻孔状单向旋转，由此分子的转子部分围绕中心烯键旋转, 推动分子通过膜，随后细胞内容物的泄漏和膜电位的丧失最终导致细菌细胞死亡。而后者涉及与膜中的特定结合位点对接以及抗生素分子的寡聚化以形成孔或离子通道，有报道对这些抗生素的耐药性并归因于耐药突变体中细胞壁和细胞膜组成和功能的改变。MMs 能够快速杀死一系列革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，包括抗生素抗性菌株和外排基因efflux敲除株，这一事实表明 MMs 的抗菌作用不涉及与细菌包膜内的特定元素的结合。相反，MMs 通过物理膜破坏的机械杀菌作用，不同于我们所知道的任何其他抗菌方式。这种分子水平的普遍的、非特异性的膜损伤也可能解释了 MM 有效根除对膜靶向剂特别敏感的持久性菌的能力。使用 MM 与荧光分子结合的进一步研究将有助于可视化 MM 在细胞膜内的精确定位，以及一旦进入细胞内，它们是否可能结合和破坏其他细胞内靶标。

革兰氏阴性菌膜的渗透性降低代表了抗菌治疗的一个重要挑战，因为它构成了限制抗生素进入细胞的屏障。MM除了直接的抗菌特性外，还能够增强原本药效降低的传统抗生素对革兰氏阴性菌的杀伤力——这是MM 诱导的革兰氏阴性细胞外膜透化（穿孔）和提高抗生素对其细胞内靶标的可及性的结果。

除了杀死活跃生长的细菌外，MMs 还能迅速消灭持久性细胞——持久性细胞被定义为在代谢上不活跃或处于休眠状态的细菌种群中暂时耐受抗生素的部分。在这种表型状态下，标准抗菌疗法所针对的生物合成过程不活跃，使其对常规抗生素具有高度耐受性。

MMs 还能够显著减少已建立的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜的细胞数量和生物量。与持久性细胞类似，生物膜被认为是抗性表型，其特征是存在异质致密的细胞外聚合物基质，包括细胞外 DNA、蛋白质和多糖，其中包埋了高密度的微生物细胞。这种复杂的环境为抗生素的扩散和渗透设置了屏障，使生物膜相关感染经常难以用传统的抗菌治疗。但完全消除生物膜所需的辐照条件远高于对哺乳动物细胞安全的辐照条件，并且在完全减少生物膜生物量所需的延长辐照时间（长达 45 分钟）下，不能排除温度的影响。MM与抗生素结合可能是一种更有效方法。

MM对哺乳动物细胞HEK和NHDF细胞的安全性和IC50剂量也进行了评估。

鉴于安全问题，研究人员使用无脊椎动物感染模型G. mellonella研究 MM 的体内抗感染能力。G. mellonella是一种成熟、廉价且维护成本低的真菌和细菌感染模型。虽然G. mellonella等昆虫没有适应性免疫反应，也不能产生抗体，但它们复杂的先天免疫系统与哺乳动物有一些相似之处。G. mellonella和小鼠对病原体的免疫反应之间的相关性表明，使用这种无脊椎动物模型获得的结果可以为哺乳动物反应提供重要的见解。皮肤伤口特别适合光介导的抗菌治疗。全身性抗微生物剂在治疗这些局部感染方面的效率有限，同时可能导致非靶标生物体产生耐药性。

在这项工作中，G. mellonella的烧伤伤口感染了两种通常与烧伤伤口相关的常见细菌：鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌。用可见光激活的 MM 治疗受感染的蠕虫降低了与鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌感染相关的死亡率。MMs 的死亡率降低（高达 83%）与传统抗生素相似或优于传统抗生素。这些结果证明了 MM 在治疗局部细菌感染方面的潜力，尽管治疗窗口很小。

未来的下一代 MM 不仅需要是有效的抗菌剂，而且还需要对细菌具有更高的选择性，同时降低对哺乳动物细胞的损害，例如，通过增加 MM 内的正电荷数量来增强它们对带负电荷的细菌膜的亲和力，减少对更为中性的哺乳动物细胞膜亲和力。与分子的定子或转子部分连接特异针对细菌的肽也可用于靶向杀死细菌。或者，通过将光激活的 MM 和常规抗生素结合使用，可以实现安全有效的抗菌效果，从而可以在亚致死 MM 浓度下发挥杀菌作用，避免潜在的 MM 毒性。

Tour认为，烧伤患者和坏疽患者遭受的细菌感染将是早期的目标。分子机器还有望“复活”被认为无效的抗菌药物。“钻穿微生物的膜可以让原本无效的药物进入细胞，克服细菌对抗生素的内在或后天耐药性。”该实验室正致力于通过将细菌特异性肽标签与钻头连接，引导它们指向感兴趣的病原体，从而更好地靶向细菌，最大限度地减少对哺乳动物细胞的损害