几种Protein A亲和层析填料纯化重组单克隆抗体效果的比较

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随着表达技术的进步以及发酵技术的优化,细胞发酵上清液中抗体的滴度大幅度提高,必然对下游纯化工艺的处理能力有更高的要求。protein A亲和层析是分离单克隆抗体的一种标准纯化方法。目前已经有很多种protein A亲和填料,其配体基本上都是大肠杆菌发酵的重组protein A。不同厂家生产的protein A填料有各自不同的基质或键合技术,从而造成填料对抗体亲和力以及对碱耐受性的差异。

来自深圳国家高技术产业创新中心等处的研究人员针对正在研发的WLB303单克隆抗体,比较了6种不同的protein A填料的动态载量,并从洗脱溶液种类和pH两个方面进行单克隆抗体纯化条件的筛选,分析纯化后样品SEC纯度和回收率。综合考虑载量、除杂效果、回收率三个因素,MabSelect填料是最适合本抗体纯化的,SEC纯度可以达到98%,回收率可以达到100%左右。基于这些数据,对MabSelect填料进行了使用寿命试验,200次循环之后载量仅衰减了5%。

protein A是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白，能够选择性地与免疫球蛋白的Fc结构域结合。protein A蛋白是由5个同源结构域和一个与细胞壁联结的结构域组成，它通过这5个同源结构域与IgG Fc结构域结合。利用重组DNA技术，在大肠杆菌中表达不含细胞壁结合域的protein A片段。protein A配体可以偶联到不同的基质上，例如交联琼脂糖、表面修饰的多孔玻璃、聚苯乙烯、陶瓷型外壳或者其它有机高分子材料，形成不同的protein A填料。由于protein A的高选择性和稳定性，在实验室和工业生产中都将protein A亲和层析作为抗体纯化的一个标准步骤。大多工艺都将protein A柱子作为纯化的第一步，从澄清的细胞培养上清液中捕获抗体。目前抗体的表达量不断提高，有些抗体甚至达到了10 g/L。这就要求protein A介质有更高的动态载量(DBC)和传质特性。

另外，工业上对protein A填料的稳定性要求很高，以获得有效的CIp清洗。因此，好的protein A填料既要保证有效的清洗，又要同时保持足够的载量。这对protein A配体是一个巨大的挑战。目前有很多protein A填料的清洗方法，然而对于大多数工艺来说NaOH是最安全、最经济的。另一方面protein A亲和层析的洗脱条件一般是在pH3~4之间，这个条件下抗体很容易聚集和沉淀。

为了降低聚集体，提高洗脱pH是可行的。目前已经有填料试图从提高洗脱的pH进行改进。因此protein A亲和层析纯化单克隆抗体时会从DBC、分辨率(纯化效果)以及清洗稳定性这三个方面进行考虑。

在这篇文章中，作者选取了6种适合大规模纯化抗体的protein A填料(4种进口和2种国产)进行纯化效果的比较，以期获得最佳纯化重组抗体的填料。通过DBC和纯化结果(样品纯度和回收率)进行比较，从中挑选出性能较好的填料进行寿命测试，最终确定适合本抗体的最佳填料。

文章指出，市面上有多种针对单克隆抗体纯化的protein A填料，在选择时首先考虑填料的动态载量，其次还应考虑填料的纯化分离效果及使用寿命。在本次试验中，Millipore的两种填料pUp和ESHMUNO A以及张江生物的iprA FF动态载量高于其它填料。洗脱液种类对抗体纯度有很大的影响，重组抗体在甘氨酸-盐酸缓冲液中纯度最高，其次是醋酸钠缓冲液，在柠檬酸缓冲液中纯度最差，因此选定甘氨酸-盐酸缓冲液作为本抗体的洗脱缓冲液。在同一洗脱缓冲液中，填料性质的差异也会影响抗体的回收率和纯度。综合载量、纯化分辨率和稳定性等的考察结果，最终选择MabSelect填料和甘氨酸-盐酸洗脱液作为本抗体的亲和层析的基础条件，再进行完整的工艺开发。这也可以为单抗药物工艺开发时protein A填料和纯化条件的筛选提供一定的参考。

（生物通）

原文检索：

几种protein A亲和层析填料纯化重组单克隆抗体效果的比较
Screening of protein A Resins for purifying Combinant Antibody

何凌冰, 李乐, 邓义熹, 蒙国基, 于玉根
HE Ling-bing, LI Le, DENG Yi-xi, MENG Guo-ji, YU Yu-gen

中国生物工程杂志, 2015, 35(12): 72-77
China Biotechnology, 2015, 35(12): 72-77
http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20151211