清华大学沈晓骅研究组发表Cell Stem Cell文章

沈晓骅课题组在《Cell Stem Cell》发表论文揭示反义长链非编码RNA顺式调控基因转录的新模式

清华大学医学院沈晓骅课题组在《Cell Stem Cell》（细胞干细胞)在线发表了题为“Divergent lncRNAs regulate gene expression and lineage differentiation in pluripotent cells”（反义长链非编码RNA调控基因表达和多能干细胞分化）的研究论文，系统揭示了长链非编码RNA顺式调控基因组上邻近基因的表达，以及它们在干细胞分化和发育中的作用。

多细胞生物拥有不同大小的基因组，比如人的基因组比秀丽线虫的大30倍，它们却拥有相似数目的蛋白编码基因（~2万个）。蛋白分子一直被认为是生命活动的载体和执行者。自从DNA双螺旋的发现和基因表达中心法则的确立（遗传信息的流动是从DNA转录为RNA，再被翻译成为蛋白），在过去多半个世纪里，生命科学研究主要集中在蛋白和编码蛋白的基因上。近年来随着高通量DNA测序技术的发展，研究表明80% 的人类基因组序列虽然能够转录表达并产生RNA ，却不能编码和翻译成蛋白。由此，产生了大量的长链非编码RNA（lncRNA）。人的基因组拥有近2万个lncRNA基因，和蛋白编码基因的数量相当。但是目前，人们对它们的了解还非常有限，lncRNA被认为是生物学中的暗物质。探索lncRNA的功能和生物学意义，对于人们认识非编码基因组、生物体的多样性和进化具有重要意义。LncRNA的功能分类及预测，是新兴的非编码RNA领域一直追寻和探索的重要问题。

沈晓骅博士于2010年底在清华大学建立独立实验室，主要致力于非编码RNA和表观遗传学研究。她的实验室利用多能干细胞分化体系为模型，通过研究特定类别有代表性的lncRNAs，过去两年来取得了一些突破性进展，揭示了非编码RNA介导的基因表达调控的新模式。她的课题组在2015年首次报导了一个非编码RNA的转录本和基因组DNA，能同时拮抗性地精细调控同一靶基因的转录表达。揭示了RNA可以作为灵活的调控因子动态传递基因组DNA上承载的精细信息，微调基因表达并参与细胞分化和发育过程。《Cell Stem Cell》特发表专文评述这项研究成果（Cell Stem Cell. 2015. 16(5): 449-50）。同时，也是F1000prime推荐的对本领域产生重大影响的论文。

2016年发表的这篇论文，是通过研究一类有非常有意思的lncRNAs - 反义长链非编码RNA（divergent lncRNAs），揭示了lncRNAs对邻近蛋白编码基因表达的一种广泛存在的顺式调控模式。早期研究发现，一些组织特异性表达的lncRNA会与基因组上邻近的蛋白编码基因在时间和空间上共同表达；但是，这种共表达的功能、机制和意义尚不清楚。沈晓骅课题组发现lncRNA基因在基因组上的分布不是随机的，并根据它们在基因组上与邻近蛋白编码基因的位置关系进行了分类。其中，反义长链非编码RNA与邻近蛋白编码基因在基因组上，以头对头地反向排列和转录（图1A）。它们占人和鼠lncRNA总数的20%，更倾向于分布在编码转录因子和发育调控基因的附近。在进化上它们比远离蛋白编码基因的lncRNAs更古老，暗示了反义长链非编码RNA可能对生物体的发育和适应性有一定的优势，使其得以在进化中保留下来。这些证据提示了反义长链非编码RNA可能通过调节邻近蛋白基因的表达，参与到转录和发育等生物学过程。

图 1. 反义长链非编码RNA与基因转录调控和生物体发育紧密相连。
A)反义长链非编码RNA（divergent lncRNAs）通过调控邻近蛋白编码基因的转录来参与与该蛋白相关的生物学过程。B)LncRNA Evx1as顺式调节EVX1表达的模式图。Evx1as RNA结合在自身转录区域，招募转录激活辅助因子Mediator，促进增强子（enhancer，‘E’)和启动子长距离的染色质互作和一个激活的表观遗传状态的形成，从而促进EVX1转录的进行。

为验证以上假说，沈晓骅课题组在不同系统中，包括干细胞分化、重编程、人乳腺癌细胞及小鼠的早期胚胎发育等，利用RNAi干扰技术沉默了24个随机挑选的反义长链非编码RNA。令人惊叹的是，敲低18个lncRNAs（75%）均导致了邻近蛋白基因的表达下降。为进一步揭示反义长链非编码RNA的分子功能和机制，沈晓骅课题组深入解析了lncRNA Evx1as在调节邻近EVX1基因表达和胚胎干细胞分化中的重要作用。 Evx1as RNA原位结合在自身转录的DNA区域，招募转录激活辅助因子Mediator，促进该区域染色质增强子与启动子的长距离相互作用和一个激活的表观遗传状态的形成，从而正向调控EVX1的基因转录（图1B）。单细胞时相表达分析表明，lncRNA Evx1as的表达早于EVX1，很可能为细胞提供一个“时机之窗”，去整合各种信号和转录的蛋白酶机器，为EVX1的快速激活做好准备。干扰lncRNA Evx1as的表达，严重阻碍了多能干细胞的分化。因此，反义长链非编码RNA，至少其中相当多的一部分，能够顺式调节邻近蛋白编码基因的转录，并参与到与之相关的发育或其它生物学过程（图1A）。反义长链非编码RNA通过细微调控发育多样性基因位点的转录水平，来精密控制这些发育相关基因的时空表达。基因表达调控的复杂性很可能导致了发育和个体表型差异的复杂性。

重要的是，基于以上顺式调控规律，人们可以根据邻近已知蛋白编码基因的功能，预测出大量未经鉴定的非编码lncRNA的功能。这种功能上的预测，将帮助科研人员更好地设计实验和研究未知lncRNA的功能，对全面认识非编码基因组的功能、基因表达调控和生物体发育具有重要意义。

沈晓骅博士为本文通讯作者（下图中），第一作者是pTN-BBS联合培养项目的清华大学博士研究生罗赛）。本文中lncRNA分类和生物信息分析由CLS项目的清华大学博士研究生卢金龙完成，lncRNA的进化分析由中科院动物研究所张勇实验室完成。另外，本课题的完成离不开沈晓骅实验室全体成员的参与和支持；同时也得到了清华大学医学院、生命学院和北京大学生命学院多位学者的建议和帮助。本研究项目受到清华-北大生命联合中心（CLS）、国家973计划和国家自然科学基金委的资助。

原文摘要：

Divergent lncRNAs Regulate Gene Expression and Lineage Differentiation in pluripotent Cells

Divergent lncRNAs that are transcribed in the opposite direction to nearby protein-coding genes comprise a significant proportion (∼20%) of total lncRNAs in mammalian genomes. Through genome-wide analysis, we found that the distribution of this lncRNA class strongly correlates with essential developmental regulatory genes. In pluripotent cells, divergent lncRNAs regulate the transcription of nearby genes. As an example, the divergent lncRNA Evx1as promotes transcription of its neighbor gene, EVX1, and regulates mesendodermal differentiation. At a single-cell level, early broad expression of Evx1as is followed by a rapid, high-level transcription of EVX1, supporting the idea that Evx1as plays an upstream role to facilitate EVX1 transcription. Mechanistically, Evx1as RNA binds to regulatory sites on chromatin, promotes an active chromatin state, and interacts with Mediator. Based on our analyses, we propose that the biological function of thousands of uncharacterized lncRNAs of this class may be inferred from the role of their neighboring adjacent genes.