茶树国家重点实验室发表miRNA最新研究成果

韦朝领教授领衔的茶树逆境生理与功能基因组研究团队长期专注miRNA在茶树抗病虫及生长发育中的作用。近日，该课题组在线发表两篇茶树芽叶发育和抗病虫响应的最新研究论文。我们非常荣幸地邀请到该团队骨干成员刘升锐博士来为大家介绍本项研究工作，分享他开展植物miRNA研究的思路。

植物中MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的具有重要调控功能的非编码RNA，其大小长约20~24nt。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体（RISC），通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译（图1）。近年来，miRNA在植物中的研究是一个热点领域，尤其在模式植物及农作物中。然而，木本植物如茶树中miRNA的鉴定及调控功能研究还相对滞后。

图1 miRNA产生及作用机制

茶是世界上最受欢迎的非酒精饮料，具有重要的保健功能以及独特香气和口感。研究表明，茶树起源于中国西南地区，主要栽培品种是山茶属茶组中的茶（C. sinensis var. sinensis）和阿萨姆种（C. sinensis var. assamica）两个变种，主要种植于热带及亚热带地区。大量研究表明，miRNA在各种植物的生长发育及抗逆响应中起着关键的调控作用，而茶树中的研究报道还较少。

研究成果：

1.参茶树芽叶发育的miRNA及其靶基因的鉴定及功能研究[1]

绝大部分干茶是由茶树一芽二叶制成，本课题组首先构建了国家级茶树品种“舒茶早”一芽二叶的miRNA文库，通过高通量测序鉴定了175个保守的miRNA和83个茶树新的miRNA，芯片分析进一步验证了93个保守的和18个新的miRNA。茎-环pCR方法验证了miRNA表达特征，5" RLM-RACE验证了miRNA及其靶基因的剪切关系（图2）。

此外，表达分析表明miRNA及其靶基因存在负调控相关性（图3）。最后，构建了一个可能的miRNA参与茶树主要次生代谢产物的调控途径网络（图4）。

图2 四个保守的miRNA及其靶基因剪切位点的验证

图3 四个保守的miRNA及其靶基因在不同组织中的表达模式分析

图4 miRNA在茶树次生代谢途径中潜在的调控功能

2.miRNA在茶树抗病虫响应中的鉴定及调控功能研究[2]

本研究共构建了机械损伤（MW），茶尺蠖取食（GA）和未处理组（CK）三个miRNA测序文库。通过高通量测序共鉴定到130个保守的miRNA，35个miRNA属于已知的miRNA家族，512个茶树中新的miRNA；其中茶尺蠖取食诱导的差异表达的miRNA中，36个和139个miRNA分别为保守的及新的miRNAs（图5和图6）。

芯片分析检测了169个GA响应的和173个MW响应的miRNAs。qRT-pCR方法进一步验证了六个GA响应的miRNA，结果与高通量测序结果高度一致（图7）。

研究还利用转录组数据鉴定了大量差异GA诱导的miRNA的靶基因，包括乙烯响应的转录因子、SpL转录因子等。最后，推断出一个miRNA参与茶树抗茶尺蠖取食的调控网络模型，主要包括受体感知、信号识别、信号转导和转录因子4个调控途径（图8）。

该研究全面分析了茶树中茶尺蠖胁迫响应的相关miRNAs表达谱，为特异诱导的miRNA的功能及茶树抗虫研究奠定了基础。

图5 三个文库中miRNA长度分布，保守和新的miRNA个数统计

图6 茶树中茶尺蠖取食诱导差异表达的保守和新的miRNA

图7 qRT-pCR进一步验证候选6个miRNA在胁迫诱导下的表达模式

图8 miRNA及其靶基因参与生物胁迫响应的调控途径

参考文献

1.Jeyaraj A†, Liu SR†, Zhang X, Zhang R, Shangguan MZ, Wei CL. (2017) Genome-wide identifcation of microRNAs responsive to Ectropis oblique feeding in tea plant (Camellia sinensis L.). Scientific Reports, 7: 13634.

2.Liu SR†, Zhou JJ†, Hu CG, Wei CL, Zhang JJ. (2017) MicroRNA-Mediated Gene Silencing in plant Defense and Viral Counter-Defense. Frontiers in Microbiology, 8: 1801.

3.Jeyaraj A†, Zhang X†, Hou Y†, Shangguan MZ, Gajjeraman p, Li YY, Wei CL. (2017) Genome-wide identification of conserved and novel microRNAs in one bud and two tender leaves of tea plant (Camellia sinensis) by small RNA sequencing, microarray-based hybridization and genome survey scaffold sequences. BMC plant Biology, 17: 212.

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